CCK-8实验——原理、步骤、注意事项
CCK8全称Cell Counting Kit-8试剂，可用于简便而准确的细胞增殖和毒性分析。
CCK-8试剂（Cell Counting Kit-8 细胞计数试剂中含有WST–8：化学名：2-(2-甲氧基-4-硝/基苯基)-3-(4-硝/基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪 硫/酸/二甲酯（1-Methoxy PMS）的作用下被细胞线粒体中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲臜产物（Formazan），生成的甲臜物的数量与活细胞的数量成正比。用酶联免疫检测仪在450nm波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。该方法已被广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞增殖试验、细胞毒性试验以及药敏试验等。
实验原理：
该试剂中含有水溶性的四唑盐WST-8[化学名：2-(2-甲氧基-4-硝/基苯基)-3-(4-硝/基苯基)-5-(2,4-二磺酸苯)-2H-四唑单钠盐]，它在电子载体1-甲氧基-5-甲基吩嗪鎓硫/酸/二甲酯(1-Methoxy PMS)的作用下被细胞中的脱氢酶还原为具有高度水溶性的黄色甲瓒产物(Formazan dye)。生成的甲瓒物的数量与活细胞的数量成正比。因此可利用这一特性直接进行细胞增殖和毒性分析。
优点：
1、使用方便，省去了洗涤细胞，不需要放射性同位素和有机溶剂；2、检测快速；3、灵敏度高，甚至可以测定较低细胞密度；4、重复性优于MTT法；5、对细胞毒性小；6、为1瓶溶液，毋需预制，即开即用。
缺点：
1、与MTT相比，CCK-8和XTT的价格比较贵。2、CCK-8试剂的颜色为淡红色，与含酚红的培养基颜色接近，不注意的话容易产生漏加或多加。
CCK-8法与普通的MTT法相比，具有显著特点：
★灵敏度高，数据可靠，重现性好
★操作简便，省时省力
★水溶性，不需要换液，尤其适合于悬浮细胞
★无需放射性同位素和有机溶剂，对细胞毒性低
★为1瓶溶液，毋需预制，即开即用
★适合于高通量药物筛选
CCK-8用途：
药物筛选、细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验
仪器和试剂：
1. 仪器：台式离心机、细胞计数仪、CO2培养箱、倒置显微镜、酶标仪(450nm滤光片)、10μL，100-200μL多通道移液器等。
2. 试剂：CCK8检测试剂盒、DMEM或其他培养基、双抗、FBS、PBS、DMSO。
实验步骤：
DAY 1
1. 对前一天培养好的细胞消化、离心、计数。
2. 在96孔板上接种100μL 3k-7k/孔的细胞，在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养24小时。
DAY 2
1. 在显微镜下观察细胞生长状态和密度，取生长状态良好，细胞分布及密度均一的孔进行实验。
2. 配制不同浓度梯度的样本溶液，如300、100、33.3、11.1、3.7、1.2、0.4、0.14uM。每个浓度三个复孔加入到96孔板中，在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养适当时间长度。如6，12，24或48小时。
DAY 3/4
1. CCK8使用前在室温下解冻并离心。
2. 用倒置显微镜检测细胞生长状态，并用4X/10X取生长状态良好，细胞分布及密度均一的孔拍照记录。
3. 在每孔中加入10μL的CCK-8溶液。
4. 在37℃、5% CO2、90%湿度条件下培养0.5-4小时。
5. 用酶标仪在450 nm处测量吸光度。
6. 用Excel及Graphpad Prism处理并分析结果。
注意事项：
1. 第一次做实验时，建议先做几个孔摸索接种细胞的数量和细胞达到实验要求的培养时间，这是因为不同的细胞生长速度不同。
2. 接种时细胞悬液一定要混匀，以避免细胞沉淀下来，导致每孔中的细胞数量不一致，最好一人接种，一人辅助混匀。
3. 培养板周围一圈孔培养液容易挥发，为减少误差，建议培养板周围的四边每孔只加培养基、PBS或水。
4. 药物样本初筛时可以适当减少浓度梯度的数量，增大浓度梯度间的倍数。若要确定样本的IC50则需要增加浓度梯度的数量，一般8-12个足矣。若有文献参考，则根据文献设置浓度梯度。
5. 加入样本时要注意培养基中血清浓度对样本的影响，部分样本可能受血清影响较大，此时需使用无血清培养基培养细胞。
6. 加样本前，要先吸出前面的培养基，但不可长期搁置防止细胞死亡，最好一块板吸完，立即加入配好的不同浓度的样本。
7. 若样本有氧化性或还原性，可在加入CCK-8之前更换新鲜培养基，去掉待测药物的影响。当样本影响比较小的情况下可以不更换培养基。
8. 拍照时若有沉淀、结晶或较脏，要用PBS洗一遍，加培养基后再加CCK8。
9. 加CCK-8时，建议斜贴着培养板壁加，不要插到培养基液面下加，容易产生气泡，干扰OD值。加CCK-8试剂时速度要快，减少试剂在移液器上的残留，加入CCK-8试剂后轻轻震培养板，为了避免加样时由于CCK-8 残留在枪头或壁上上所带来的误差。
10. CCK-8反复冻融会增加背景值，干扰实验测定。
11. 设置实验孔 (含有细胞的培养基、CCK-8、待测物质)
阴性对照孔 (含有细胞的培养基、CCK-8、不含待测物质)
阳性对照孔 (含有细胞的培养基、CCK-8、阳性对照样本)
空白孔 (不含细胞和待测物质的培养基、CCK-8)
实验结果计算公式：
细胞存活率=[(实验孔-空白孔)/(阴性对照孔-空白孔)]×100%
抑制率=[(阴性对照孔-实验孔)/(阴性对照孔-空白孔)]×100%
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