蛋白免疫印迹（蛋白质印迹）的基本原理及操作步骤
免疫印迹（immunoblotting）又称蛋白质印迹（Western blotting），是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。该法是在凝胶电泳和固相免疫测定技术基础上发展起来的一种新的免疫生化技术。由于免疫印迹具有 SDS-PAGE 的高分辨力和固相免疫测定的高特异性和敏感性，现已成为蛋白分析的一种常规技术。免疫印迹常用于鉴定某种蛋白，并能对蛋白进行定性和半定量分析。结合化学发光检测，可以同时比较多个样品同种蛋白的表达量差异。
应用：
用于检测和检查不同样品设置中细胞类型中存在的感兴趣蛋白质的丰度。它还可用于检测蛋白质中的翻译后修饰(PTM)。
基本原理：
免疫印迹（Western Blot） 采用的是聚丙/烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。SDS-PAGE 可对蛋白质样品进行分离，转移到固相载体——例如硝酸纤维素薄膜（NC）上。固相载体可以吸附蛋白质，并保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。转移后的 NC 膜就称为一个印迹（blot），用蛋白溶液（如 5%BSA 或脱脂奶粉溶液）处理，封闭 NC 膜上的疏水结合位点。用目标蛋白的抗体（一抗）处理 NC 膜——只有待研究的蛋白质才能与一抗特异结合形成抗原抗体复合物，这样清洗除去未结合的一抗后，只有在目标蛋白的位置上结合着一抗。用一抗处理过的 NC 膜再用标记的二抗处理，二抗是指一抗的抗体，如一抗是从鼠中获得的，则二抗就是抗鼠IgG 的抗体。处理后，带有标记的二抗与一抗结合形成抗体复合物可以指示一抗的位置，即是待研究的蛋白质的位置。
优点：
免疫印迹法是一项分析抗原、抗体的技术。
1.湿的固定化基质膜柔韧, 易于操作；
2.固定化的生物大分子可均一的与各种免疫探针接近, 不会象凝胶那样受孔径阻隔；
3.免疫印迹分析只需少量试剂；
4.孵育、洗涤的时间明显减短；
5.可同时制作多个拷贝, 用于多种分析和鉴定；
6.结果以图谱形式可长期保存；
7.免疫探针可通过降低PH值等方法, 象抹去录音磁带一样将探针抹掉, 再换用第二探针进行分析检测。免疫印迹法的应用范围及优点不仅局限于此, 它必将随着这一方法的深入研究而不断发展和完善。
操作步骤：
1.组织或细胞裂解：将需要检测的细胞或组织样本进行裂解，以释放蛋白质。常用的裂解缓冲液包括RIPA缓冲液和NP-40缓冲液等。
2.蛋白质浓度测定：使用蛋白质浓度测定方法（如BCA或Bradford法）确定样品中的总蛋白质浓度。
3.蛋白质电泳：将样品中的蛋白质根据大小通过聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离。在电泳过程中，样品通常会与还原剂（如β-巯基乙醇）和离子变性剂（如SDS）混合，以使蛋白质变性并带有负电荷。
4.转膜：将分离的蛋白质从凝胶转移到聚合物膜（通常是聚偏氟乙/烯膜或硝酸纤维素膜）上。这通常通过电泳转印（electroblotting）完成，其中将膜与凝胶层叠放置，并应用电流使蛋白质迁移至膜上。
5.阻断：将膜放入含有蛋白质阻断剂（如牛血清蛋白、脱脂奶粉或鱼胶）的缓冲液中，以阻止非特异性结合。
6.一抗孵育：将膜与目标蛋白质特异性的一抗（抗体）溶液孵育，使一抗与目标蛋白质发生特异性结合。
7.洗涤：用缓冲液反复洗涤膜，以去除非特异性结合的一抗。
8.二抗孵育：将膜与与一抗的宿主物种不同、带有酶标记的二抗孵育。二抗将特异性地与一抗结合。
9.再次洗涤：用缓冲液反复洗涤膜，以去除非特异性结合的二抗。
10.信号检测：添加特定底物（如光敏底物或发光底物），使酶标记的二抗产生可观察的信号。该信号通常是光辐射或发光。
11.成像和分析：使用化学发光设备（如X光片或光学成像系统）记录膜上的信号，并进行定量分析。
注：在每一步中因采用的具体实验方法不同, 可构成多种免疫印迹分析系统。
