CCK-8细胞实验原理及步骤

原理：
CCK-8试剂盒用于快速灵敏地检测细胞增殖和细胞毒性。工作原理为：在电子耦合试剂存在的情况下，WST-8（化学名：2-(2-甲氧基-4-硝苯基)-3-(4-硝苯基)-5-(2,4-二磺基苯)-2H-四唑单钠盐），可以被线粒体内的脱氢酶还原生成高度水溶性的橙黄色的甲臜产物（formazan），其颜色的深浅与细胞增殖成正比，与细胞毒性成反比，对同样的细胞，颜色的深浅和细胞数目呈线性关系。使用酶标仪在450nm波长处测定OD值，可以间接反映活细胞的数量。

用途：
可用于细胞增殖测定、细胞毒性测定、肿瘤药敏试验等。

1.种板数：根据你摸索的，或者查阅文献确定你需要的种板浓度，根据种板浓度对细胞悬液进行稀释，通常细胞增殖实验每孔加入约1000-2000个细胞100ul，细胞毒性实验每孔加入约5000～10000个细胞100ul（具体每孔所用的细胞的数目，需根据细胞的大小，细胞增殖速度的快慢等决定）。

2.种板：以96孔板为例，96孔板横向是1-12的数字，纵向是A-H，可做多个实验组，每组设置4-6个复孔，同时设置空白组，最边缘孔加入PBS缓冲液减少蒸发带来的影响，然后将细胞置于37℃ 5%CO2细胞培养箱中培养12-24 h。

3.加药及加药后孵育时间：观察细胞细胞贴壁良好，吸出各孔培养基，实验组加入含不同浓度药物的培养基，空白组加入不含药物培养基，然后将96孔板在37℃ 5% CO2空气的细胞培养箱中孵育适当时间，根据不同实验细胞需求选择适当的孵育条件和时间。

4.加入CCK-8：两种方法，每孔直接加入10ul的CCK-8溶液，或者配置成含10%CCK-8溶液的培养基以换液的形式加入,注意加入过程中避免产生气泡，可以将枪头浸入培养液中缓慢加入。

5.加入CCK-8后孵育时间：将加完CCK-8的培养板放入37°C 5%CO2 培养箱中孵育1-4h，CCK-8试剂加入后孵育时间也需要自己摸索，随着时间的增加，OD值就会增大。可以在0.5h、1.0h、2.0h分别测OD值，把OD值控制在1.0左右。

6.测OD值：将96孔板取出，酶标仪检测各孔在450nm波长处的OD值，分析处理数据，绘制增殖曲线。

步骤：
1）制备细胞悬液，计数。

2）在96孔板中接种细胞悬液，每孔约100μl，同样的样本可做3个重复。

3）将培养板放入培养箱中预培养一段时间（37℃, 5%CO2），细胞贴壁需要大约2-4h，如果是悬浮细胞，该步骤可以省去。

4）每孔各加入10μl CCK-8溶液，由于加入的CCK-8量比较少，可能会因试剂沾在孔壁上而带来误差，建议在加完试剂后轻轻晃动培养板以帮助混匀，或者直接配置含10%CCK-8的培养基，以换液的形式加入。另外注意，加样的过程中尽量不要产生气泡。

5）将培养板放入培养箱中孵育1-4h。因为细胞种类不同，形成的formazan的量也不一样，所以如果显色不够的话，可以延长培养时间，特别是血液细胞形成的formazan很少，需要较长的显色时间（5-6h）。

6）酶标仪测定450nm处的吸光值（OD）。

7）若暂时不测定OD值，可以在各孔中加入10μl 0.1 M的HCL溶液或者1% w/v SDS溶液，室温下避光保存，这样可以保证OD值在24h内不发生变化。